9.8: Платинова ДНК, спеціально для сайту\(\;^{154}\)

Last updated
Save as PDF

Page ID: 20033

\( \newcommand{\vecs}[1]{\overset { \scriptstyle \rightharpoonup} {\mathbf{#1}} } \) \( \newcommand{\vecd}[1]{\overset{-\!-\!\rightharpoonup}{\vphantom{a}\smash {#1}}} \)\(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \(\newcommand{\id}{\mathrm{id}}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\) \( \newcommand{\kernel}{\mathrm{null}\,}\) \( \newcommand{\range}{\mathrm{range}\,}\) \( \newcommand{\RealPart}{\mathrm{Re}}\) \( \newcommand{\ImaginaryPart}{\mathrm{Im}}\) \( \newcommand{\Argument}{\mathrm{Arg}}\) \( \newcommand{\norm}[1]{\| #1 \|}\) \( \newcommand{\inner}[2]{\langle #1, #2 \rangle}\) \( \newcommand{\Span}{\mathrm{span}}\)

a. проблема

Значна частина інформації, отриманої про механізм дії цисплатину, була отримана в результаті експериментів, де зв'язування PT-ДНК відбулося in vivo або in vitro, з використанням ДНК випадкової послідовності, що має всі доступні мішені для препарату. У цих дослідженнях платинація контролюється неорганічною хімією цис-DDP в середовищі і доступністю цільових ділянок на ДНК, про що вже говорилося досить докладно. Таким чином, ця ситуація найкраще представляє дію наркотиків, оскільки вона насправді відбувається в пухлинній клітині. З іншого боку, результуючий спектр аддуктів ДНК ускладнює, якщо не неможливо, зрозуміти структурні та функціональні наслідки будь-якого конкретного аддукта. Для вирішення цієї проблеми була розроблена методика, при якій єдиний платиновий аддукт вбудований в унікальне положення в геномі. Цей підхід є потужним і має потенціал для поширення на вивчення багатьох інших препаратів на основі металів. У цьому розділі ми обговорюємо стратегію, яка використовується для побудови таких спеціально платинованих молекул ДНК, та інформацію, отриману до цього часу від їх вивчення. Деякі види використання вже були обговорені.

b. синтез і характеристика

Малюнок 9.29 відображає карту генома, побудованого шляхом вставки платинованих або неплатинованих додекануклеотидних дуплексів d (PTPCPTPGPGPGPGPPCPCPTppppppcppppcppcppcpcpcpcpcptpcpcpcpgpcptppgpcptppgpcpgpcpgpa) в ДНК з бактеріофага M13mp18. Цей геном був побудований наступним чином. ¹⁵⁴ Дволанцюгова ДНК з M13mp18 була вперше перетравлена Hinc II, рестрикційним ферментом, який розпізнає унікальну послідовність шести основ пари в ДНК і розщеплює там подвійну спіраль, залишаючи тупий кінець (без нависаючих основ) місце розщеплення. Неплатинований дуплекс додекамера був наступним лігірованим у сайт Hinc II, а ДНК ампліфікувалася in vivo. Додекамер може вставлятися в геном у двох різних орієнтаціях, бажана з яких під назвою M13-12A-Stu I була ідентифікована шляхом секвенування ДНК. Наявність вставки в новій ДНК перевіряли за її чутливістю до рестрикційного ферменту Stu I, який розщеплюється в послідовності d (AGGCCT), однозначно розташованої в додекамерній вставці, і відсутністю розщеплення Hinc II, ділянка для якого була знищена. Далі, Hinc II-лінеаризованої реплікативної форми (RF) ДНК M13mp18 було дозволено сформувати гетеродуплекс із надлишком вірусної ДНК (який має лише нитку + у присутності денатурантного формаміду, який був діалізований під час експерименту. Отримана кругова ДНК має щілину в мінус нитку, в яку лігували платинований d (TCTAG*G*CCTTCT) (рис. 9.30). Останній матеріал був підготовлений методами, описаними в розділі V.D.5.a, і характеризується спектроскопією ЯМР ¹ Н. Отримана ділянка-специфічно платинована ДНК містить єдиний cis - [Pt (NH ₃) ₂ {d (PgPg)}] внутрішньожильний зшивання, вбудований в унікальну позицію. Методика є загальною і була використана для створення інших відомих сайтів аддуктів платинової ДНК, спеціально в M13mp18.

Малюнок 9.29 - Карта генома, створеного шляхом введення CIS-DDP платинованого або неплатинованого d (TpcPPTPGPGPGPPCptPtPcPtPCPcPtPCPcPcptPCPcPcPcPcptPgpcPgpcptPgpcPgpcptPgpcPgpcPgpcPgpcPgpcPgPgpcPtPGP

Малюнок 9.30 - Схема побудови платинізованих геномів на ділянках за допомогою гетеродуплексного синтезу (відтворюється за дозволом довідки 154).

Хімічні властивості платинованої ДНК, що отримала назву M13-12A-Pt (-) -Stu I, досліджувалися за допомогою експериментів ферментативного, травного та гелевого електрофорезу. Платина повністю пригнічує розщеплення ДНК Stu I, як і очікувалося від попередніх досліджень картування рестрикційних ферментів. _{_{Крім того, виявлено, що внутрішньожильні зшивні зв'язки cis - [Pt (NH ₃) ₂ {d (PgPg)}] і cis - [Pt (NH 3) 2 {d (PaPg)}] інгібують різноманітні ДНК-полімерази, при цьому лише невелика кількість шунтування ураження платини.}} ¹⁴⁹ Ці результати свідчать про те, що найпоширеніші аддукти цисплатину на ДНК здатні ефективно блокувати реплікацію.

c. біологічні властивості

Коли ДНК M13-12A-Pt (-) -Stu I була введена в клітини кишкової палички шляхом перетворення, синтез ДНК був безперебійним, оскільки клітина може як відновити пошкодження, так і використовувати немодифіковану (+) нитку для синтезу. Отже, дещо інша стратегія була використана для побудови одножильних ДНК M13-12A-Pt (+) -Stu I, деталі якої доступні в іншому місці. ¹⁵⁴ Цей платиновий шаблон, в якому пошкодження не можуть бути ні відремонтовані, ні обійти відомими механізмами in vivo, потім був перетворений в клітини E. coli, спільно покриті клітинами GW5100. У цих умовах реплікація вірусної ДНК виявляється\(\beta\) експресією гена -галактозидази, що при наявності відповідних реагентів в середовищі призводить до утворення блакитних бляшок на чіткому тлі. Результати чітко вказують на те, що набагато менше бляшок з'являється при введенні в клітини M13-12A-Pt (+), ніж при використанні M13-12a-u (+), де u позначає немодифіковану ДНК. У трьох повторах цього експерименту виживання ДНК, що містить лише один cis - [Pt (NH3h {d (pgPg)}] зшивання становив лише 11 ± 1 відсоток.

Ці дані дають однозначний доказ того, що найбільш частий аддукт ДНК, утворений цисплатином, є токсичним, здатним пригнічувати реплікацію, коли на природному шаблоні ДНК з 7167 нуклеотидів присутній лише одне подібне ураження. Той факт, що цілих 10 відсотків перетворених клітин можуть обходити або відновлювати ураження, також представляє інтерес, і паралельно з результатами, виявленими in vitro. У суміжних роботах було встановлено, що цис - [Pt (NH ₃) ₂ {d (PgPg)}] внутрішньожильний зшивання не дуже мутагенний, але що cis - [Pt (NH ₃) ₂ {d (pPg)}}] внутрішньопрядні аддукти значно більше. Цей висновок важливий, оскільки мутації можуть призвести до довгострокового виробництва вторинної пухлини у пацієнтів, які отримували цисплатин. Методологія надає спосіб скринінгу нових сполук, які хотіли б бути однаково ефективними при інгібуванні реплікації, але менш мутагенними. Крім того, за допомогою ремонтодефіцитних мутантних клітинних ліній, а також стійких до цисплатину клітин можна вивчити ефекти варіювання властивостей клітин господаря. Включення спеціально платинованих послідовностей ДНК у відповідні човникові вектори також полегшить дослідження токсичності, ремонту та стійкості клітин ссавців.

д. проспект емісії

Вищевикладене обговорення ілюструє потужність спеціально платинованих ДНК як зонда молекулярного механізму препарату. Нагадаємо, що подібні стратегії застосовувалися для отримання однозначно модифікованої ДНК при згинанні ^92,93 і розмотуванні ⁹⁵ експериментів, розглянутих раніше. В принципі, ця методика може бути застосована для вивчення інших аспектів молекулярного механізму інших металохіміотерапевтичних засобів. Вимоги - це синтетичний шлях до унікально модифікованого генома, для якого повинні піддаватися як неорганічна координаційна хімія, так і молекулярна біологія, аддукт, стабільний до біологічних умов синтезу ДНК, і метод (як правило, генетичний) для оцінки досліджуваних біологічних ефектів. Спеціально платинові ДНК дозволяють біонеорганічному хіміку мати максимальний контроль над генетикою і повинні продовжувати надавати цінну інформацію про молекулярний механізм дії цисплатину.